A recidiva permanece a principal causa de mortalidade na leucemia linfoide aguda (LLA) pediátrica, frequentemente associada à resistência das células leucêmicas aos quimioterápicos. Entre os mecanismos envolvidos, está o efluxo mediado por transportadores da família ATP-binding cassette (ABC). Considerando que níveis de expressão gênica ou proteica nem sempre refletem a atividade funcional desses transportadores, este trabalho propôs o desenvolvimento de métodos de quantificação relativa do acúmulo intracelular de vincristina (VCR) e idarrubicina (IDR) em células primárias de LLA pediátrica, por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS). Os métodos apresentaram linearidade adequada (r² ≥ 0,98), seletividade satisfatória e carryover < 6% nas concentrações de trabalho, indicando confiabilidade nas análises. As condições ideais foram definidas como 1 µM e 3 horas de incubação para VCR, e 0,1 µM e 1 hora para IDR, utilizando 2,5 milhões de células primárias por ensaio. Análises em amostras primárias mostraram correlação positiva entre o volume celular e o acúmulo intracelular de ambos os fármacos, sugerindo que o tamanho celular pode influenciar a quantidade internalizada. No entanto, após normalização pelo volume celular, não foi observada correlação significativa entre o acúmulo e os parâmetros de sensibilidade farmacológica aos fármacos (LD50 e AUC), possivelmente devido ao número reduzido de amostras (n=6) e à natureza multifatorial da resistência. Em conjunto, os métodos desenvolvidos demonstram viabilidade e aplicabilidade para a avaliação funcional direta do acúmulo intracelular de fármacos em células primárias, configurando ferramentas promissoras para estudos futuros de influxo, efluxo e resistência quimioterápica, com potencial de aplicação em abordagens personalizadas de tratamento.