Na terapia fotodinâmica antimicrobiana, o mecanismo de ação é através do uso de um fotossensibilizador não tóxico que será ativado por luz laser de baixa intensidade com comprimento de onda específico que causará apoptose ou necrose das células coradas. A duração do mecanismo de ação e o grau de penetração do fotossensibilizador são curtos em sistemas biológicos e parecem depender de quanto o fotossensibilizador penetra nos túbulos dentinários. Este estudo teve como objetivo avaliar o impacto da ativação ultrassônica do fotossensibilizador na eficácia da Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana (aPDT) na redução do biofilme multiespécies de Enterococcus faecalis, Candida albicans e Escherichia coli e endotoxina (LPS) no canal radicular. Trinta de pré molares inferiores foram selecionadas e contaminados com os microrganismos e divididos em 3 grupos (n=10). A solução salina foi utilizada como grupo controle, G1 (Soro fisiológico), G2 (aPDT) utilizando o azul de metileno 0,005% (fotossensibilizador) no canal durante 3 minutos e após foi utilizado o laser vermelho com potência de 100Mw e energia de 9J/cm2 durante 90 segundos. G3 (aPDT + Ultrassom) Azul de metileno ativado por ultrassom durante 20 s seguido pelo protocolo da aPDT como no grupo 2. As amostras microbiológicas foram coletas antes e após os protocolos de desinfecção para contagem formados de colônicas (UFC). A cultura microbiana foi utilizada para terminação das unidades formadoras de colônias – UFC. Os níveis de LPS foram mensurados usando limulus amoebocyte lisate (LAL). Todos os espécimes iniciais tiveram crescimento de bactérias viáveis em ágar anaeróbio fastidioso (FAA), com uma média de 105 UFC mL-1. aPDT foi efetiva em diminuir microrganismos viáveis (P<0,05), enquanto houve uma diminuição significativa (P<0,05) nas amostras tratadas com aPDT+U em relação àquelas submetidas à aPDT convencional. LPS foram detectados em todas as amostras iniciais, com valores médios de 18.84 EU/mL, aPDT e aPDT+U diminuíram significativamente os níveis de LPS e LTA (P<0,05), com diferença estatística entre os grupos em relação à aPDT+U (P<0,05). A ativação ultrassônica do fotossensibilizador na aPDT aumentou o potencial antimicrobiano contra microrganismos viáveis de biofilme multiespécies de E. faecalis, C. albicans e E. coli, ao mesmo tempo que reduziu os níveis de LPS.